Hallo zusammen und herzlich willkommen zum heutigen Webinar mit der Webinar-Tierärztin. Mein Name ist Catherine Bell und ich freue mich sehr, Sie heute durch diese Sitzung zu führen, die freundlicherweise von Zaita gesponsert wird. Bevor wir beginnen, möchte ich noch kurz ein paar organisatorische Hinweise geben.
Wir freuen uns sehr, die heutige Referentin live bei uns zu haben. Das bedeutet, dass Sie am Ende der Fragerunde die Möglichkeit haben, Ihre Fragen direkt an sie zu stellen. Sollten Ihnen also während der Sendung Fragen einfallen, schreiben Sie diese bitte einfach in das Feld unten. Wir werden sie dann am Ende beantworten. Wie immer gilt das auch für alle, die sich das gefragt haben.
Ihre Zertifikate stehen Ihnen zur Verfügung, sobald die Sitzung auf die Webinar-Plattform für Tierärzte hochgeladen wurde. Normalerweise benötigen wir dafür 48 Stunden, sodass sie spätestens am Wochenende für Sie bereitstehen. Nun aber zurück zu unserer heutigen Sitzung. Ich freue mich sehr, dass Dr. Melanie Dobromilsky dabei ist.
Melanie ist Spezialistin für diagnostische Pathologie bei Kleintieren und verbindet ihre klinische Expertise mit Lehre für Studierende und Doktoranden sowie mit vielfältigen Forschungskooperationen. Sie promovierte 2009 in Molekularimmunologie und wurde 2014 zum Fellow des Royal College of Pathologists ernannt. Darüber hinaus ist Melanie als Honorardozentin für Anatomische Pathologie am Royal Veterinary College tätig.
Ihre beruflichen Interessen umfassen Katzenpathologie, Immunhistochemie sowie diagnostische und prognostische Forschung. Besonders am Herzen liegt ihr die praxisorientierte Schulung von Tierärzten, um ihnen zu ermöglichen, pathologische Befunde optimal zur Verbesserung der Patientenergebnisse zu nutzen. Herzlich willkommen, Melanie, und vielen Dank, dass Sie heute live dabei sind.
Ein herzliches Dankeschön geht noch einmal an Saya für die Unterstützung dieser Veranstaltung. Ich übergebe nun das Wort an Sie. Vielen Dank.
Vielen Dank für die nette Einführung. Ja, im heutigen Webinar geht es um PCR, und Sie fragen sich vielleicht, warum ein Histopathologe über PCR spricht, da es sich ja um eine sehr molekulare Technik handelt. Ich werde es Ihnen erklären. Bevor ich Pathologe wurde, ja, bevor ich überhaupt daran dachte, Pathologe zu werden…
Ich habe promoviert und dabei viel mit PCR gearbeitet. Viele PCR-Verfahren waren quasi Neuland, also ausgehend von Gensequenzen. Dann suchte ich nach geeigneten Zielbereichen, entwarf die Primer, stellte ihre Funktionsfähigkeit sicher und optimierte sie. PCR spielte also eine große Rolle und ermöglichte mir ein sehr fundiertes Verständnis der praktischen PCR-Arbeit im Labor. Natürlich lernte ich dabei auch alle möglichen Vor- und Nachteile kennen, Probleme und Fehlfunktionen.
Als ich dann Pathologe wurde und in die Diagnostik wechselte, wurde die PCR natürlich zu einem immer wichtigeren Werkzeug in unserem diagnostischen Repertoire. Viele von uns nutzen PCR-basierte Tests täglich, aber viele verstehen nicht genau, wie sie funktionieren. Und auch nicht, warum dieses Wissen so wichtig ist, um die Testergebnisse richtig zu interpretieren.
Deshalb sind wir heute hier. In diesem Vortrag erklären wir die Funktionsweise der PCR. Dies wird einen wesentlichen Teil des Vortrags ausmachen. Wenn Sie bereits wissen, wie die PCR funktioniert, wird es Sie wahrscheinlich langweilen, da wir zu den Grundlagen zurückkehren und jeden Schritt sowie jede Komponente der Reaktionsmischung durchgehen werden, um ein wirklich gutes Verständnis der Funktionsweise und der Bedeutung all dieser Dinge zu erlangen. Wenn Sie die PCR also bereits verstehen, ist dieses Webinar wahrscheinlich nicht das Richtige für Sie.
Wir werden uns aber auch die verschiedenen PCR-Typen und einige gängige Begriffe ansehen, damit Sie diese gut verstehen. Wir werden die Vor- und Nachteile von PCR-Tests betrachten und vor allem die Bedeutung der Testergebnisse und deren Anwendung im klinischen Alltag. Wir werden einige Fallstudien ansehen, um zu zeigen, wo PCR bereits im klinischen Alltag eingesetzt wird.
Zum Schluss beantworten wir noch einige Fragen zu Dienstleistungen, Plattformen und zukünftigen Trends der PCR in der klinischen Praxis. Ich hatte ja bereits angekündigt, dass wir mit den Grundlagen beginnen würden. So einfach wie möglich erklärt.
Wir werden also eine kurze Zusammenfassung zu Genen, Boten-RNA und all dem geben. Gene bestehen natürlich aus DNA. Hoffentlich erinnern Sie sich daran noch aus Ihrem Biologiestudium oder sogar aus der Oberstufe.
Jedes Gen besteht aus verschiedenen Abschnitten, den sogenannten Exons und Introns. Die Exons enthalten die Sequenz, die für das nachfolgende Protein codiert. Zwischen den Exons befinden sich die Introns, nicht-codierende DNA-Abschnitte, die als eine Art Abstandshalter fungieren.
Früher dachte man, es handele sich dabei nur um nutzlose DNA, und man wisse nicht genau, welche Funktion sie haben. Doch ich glaube, wir finden immer mehr davon. Sie könnten tatsächlich eine Funktion erfüllen. Für diesen Vortrag können wir sie uns aber einfach als Zwischenräume zwischen den Axonen vorstellen.
Jedes Gen besitzt am Anfang einen sogenannten Startpunkt. Dies ist die Promotorregion. Hier bindet das Enzym und löst so die Transkription aus.
Es ist aber auch deshalb so wichtig, weil es steuert, ob ein bestimmtes Gen zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimiert wird oder nicht. Es ist also ein wirklich wichtiger Bestandteil des Gens. Und am Ende befindet sich dann ein Stoppcodon, das lediglich ein Signal darstellt.
Es handelt sich um eine bestimmte Nukleotidsequenz, die der Transkription signalisiert, an dieser Stelle zu stoppen und den Faden abzuketten. Ähnlich wie beim Stricken am Ende einer Reihe. Der Prozess, durch den DNA in Boten-RNA (mRNA) umgewandelt wird, heißt Transkription.
Es gibt noch einen weiteren Schritt namens Splicing. Dabei wird aus der Prä-mRNA, die sowohl Exons als auch Introns enthält, die mRNA hergestellt, die nur noch die Exons, also die codierenden Abschnitte, enthält. Anschließend findet die Translation am Ribosom statt. Hier wird die mRNA in eine Aminosäurekette übersetzt. Ich kann heute leider nicht auf den Triplettcode und all das eingehen, aber es ist ein wichtiger Teil des Prozesses.
Und die Aminosäuren, die sich entlang von Ketten aneinanderreihen, bilden die Proteine. Das ist eine sehr einfache Zusammenfassung. Wenn wir an die DNA- und RNA-Moleküle selbst denken, wissen Sie wahrscheinlich, dass diese aus einer Abfolge von Molekülen, den sogenannten Nukleotiden, bestehen.
Und davon gibt es vier verschiedene Arten. Da ist Adenin, das ich hier als A dargestellt habe. Dann gibt es Cytosin, das C, und Guanin, das G.
Und dann gibt es noch Thymoidin, falls es sich um DNA handelt. In RNA wird dieses jedoch durch Uracil ersetzt. Wenn Sie also in einer Nukleotidsequenz ein U sehen, handelt es sich um RNA, und es ist Uracil. Ich habe sie hier als kleine, schematische Moleküle dargestellt: C, A, G und T sowie das Zucker-Phosphat-Rückgrat, das für die Struktur sehr wichtig ist.
Eine der faszinierendsten Eigenschaften der DNA – und eine der Voraussetzungen für die PCR – ist, dass wir wissen, dass sie aus zwei Strängen besteht. Diese beiden Stränge sind komplementär. Denn beim Aufbau des DNA-Moleküls paart sich Guanin (G) immer mit Cytosin (C) und Thymin (T) immer mit Adenin (A).
Es handelt sich also um etwas, das wir als komplementär bezeichnen. Wenn man also weiß, dass der erste Strang T CAG lautet, weiß man auch, dass der komplementäre Strang A, G, T, C lautet.
Diese Moleküle ordnen sich alle an und werden, wie bereits erwähnt, vom Zucker-Phosphat-Rückgrat stabilisiert. Thymin (T) und Adenin (A) sind durch zwei Wasserstoffbrückenbindungen verbunden, Cytosin (C) und Guanin (G) durch drei. Das ist wichtig, und wir werden später noch einmal darauf zurückkommen, aber es gibt einen Unterschied zwischen diesen beiden Paaren.
Und dann windet sich dieser DNA-Doppelstrang um die eigene Achse und bildet so die klassische Doppelhelix der DNA. Ich möchte das mit der Komplementarität noch einmal betonen, denn sie ist für das Verständnis der PCR unerlässlich. Ein einzelner DNA-Strang, bei dem alle Basenpaare freiliegen, dient als Matrize.
Wir nehmen also diesen Matrizenstrang, und wenn wir seine Sequenz kennen, können wir vorhersagen, welche Nukleotide daran binden werden und wie die komplementäre Sequenz des Strangs aussieht. Wir wissen also, dass T an A, D an C usw. bindet. Diese Komplementarität ist für die Funktionsweise der PCR von entscheidender Bedeutung.
Das werden wir uns als Nächstes ansehen. Wenn Sie also einige interessante Wörter in die KI eingeben, generiert sie folgendes Bild. So stellt sie sich den molekularen Fotokopierer vor.
Als ich im Labor war, kann ich mich jedenfalls nicht erinnern, dass irgendetwas so aussah. Ich mag es, wie die KI-Bilder immer so fröhlich wirken, aber ich kann mich nicht erinnern, ich weiß nicht einmal, was diese kleinen blauen Oktopusse sind, die da herumlaufen und irgendetwas tun. Also, was ist PCR?
Es handelt sich um eine molekulare Technik, die entwickelt wurde, um eine sehr spezifische Sequenz des genetischen Codes innerhalb eines viel größeren Pools genetischer Information zu erkennen. Sobald diese spezifische Sequenz gefunden ist, wird sie so lange verstärkt, bis sie auf verschiedene Weise nachweisbar ist. Daher stammt das Konzept des molekularen Fotokopierers.
Und tatsächlich war das genau die Art von Gerät, die wir während meiner Doktorarbeit benutzt haben, und ich kann mich leider nicht erinnern, dass es ein Smiley-Gesicht hatte. Kommen wir nun zum Detail, wie die PCR funktioniert. Um das zu verstehen, muss man sich zunächst überlegen, welche verschiedenen Elemente in der Reaktionsmischung enthalten sind. In jedem dieser kleinen Röhrchen befindet sich eine Mischung verschiedener Substanzen, und genau dort findet die Reaktion statt.
Das ist also unsere Zutatenliste, so ähnlich wie ein Kuchenrezept. Darin enthalten ist eine Mischung aus Puffer und Salzen. Die Salzkonzentration variiert je nach PCR-Ansatz. Im Rahmen der Optimierung und Validierung wurde die Salzkonzentration angepasst, um eine optimale Reaktion zu erzielen.
Es besteht größtenteils aus Wasser, aber man muss extrem vorsichtig sein. Man kann nicht einfach irgendein Wasser verwenden, es muss absolut steril und sauber sein. Es darf natürlich keine verunreinigende DNA oder RNA enthalten, da man sonst falsch positive Ergebnisse erhält. Man benötigt die freien Nukleotide, also die Guanine (G), Cytosine (C), Thymin (T) und Adenine (A).
Dies sind die Bausteine, aus denen die neue DNA gebildet wird, die in dieser Reaktion entsteht. Sie benötigen ein Enzym, das diese Reaktion katalysiert. Dieses Enzym heißt TAC-Polymerase, und wir werden auf der nächsten Folie genauer darauf eingehen, da es wichtig ist. Sie benötigen natürlich die Probe, die Sie testen möchten. Diese kann die Sequenz enthalten, die Sie mit Ihrer spezifischen PCR amplifizieren möchten, muss dies aber nicht.
Und dann benötigen Sie zwei sogenannte Primer. Die Primer sind tatsächlich sehr wichtig; sie sind ein entscheidender Bestandteil der PCR. Um zu verstehen, wie die PCR funktioniert und warum manche PCRs besser sind als andere, müssen Sie wissen, was Primer sind und welche Rolle sie spielen. Denn jeder PCR-Test verwendet ein eigenes, spezifisches Primerpaar, das speziell für diesen Test entwickelt wurde. Schauen wir uns die TAC-Polymerase also etwas genauer an.
Der Name „Tack“ stammt also vom Namen des Bakteriums, aus dem es gewonnen wird: Themis aquaticus. Das bedeutet „Tack“. Und so stellt sich KI vor, wie „Tack“ aussieht – ziemlich niedlich. Praktischerweise ist dieses Bakterium thermophil, das heißt, es hat sich an sehr hohe Temperaturen angepasst. Ein Beispiel dafür ist das Yellowstone-Nationalpark-Bakterium auf diesem Bild.
Dies ist eine der heißen Quellen, und in diesem gelben Bereich hält sich dieses Bakterium besonders gern auf. Es hat sich also an sehr hohe Temperaturen angepasst. Und dieses Enzym hat die Hauptfunktion, neue DNA zu synthetisieren, was für uns sehr nützlich ist.
Es nimmt also einzelne Nukleotide aus Ihrer Reaktionsmischung, also G, T, C und A – nicht das B-Nukleotid, das sich hier oben befindet; ich habe noch nie von einem B-Nukleotid gehört. Es nimmt diese einzelnen Nukleotide und setzt sie zu einem brandneuen DNA-Strang zusammen. Und das geschieht, indem es einen anderen DNA-Strang als Vorlage verwendet; Sie erinnern sich, was ich über die Komplementarität gesagt habe.
Die bereits vorhandene DNA dient also als Vorlage. Wie bereits erwähnt, funktioniert sie glücklicherweise bei hohen Temperaturen und ist selbst bei sehr hohen Temperaturen stabil. Daher müssen wir die DNA denaturieren, was im Labor sehr praktisch ist, da wir nicht bei jedem PCR-Zyklus neues Enzym hinzufügen müssen. Das ist der entscheidende Punkt. Ein weiterer wichtiger Aspekt, auf den ich nun eingehen möchte, sind die Primer.
Jede PCR-Reaktion benötigt also ein Primerpaar, und diese Primer müssen so designt sein, dass sie an ganz spezifische DNA-Abschnitte binden. Damit Ihre PCR spezifisch ist, müssen Ihre Primer an eine eindeutige Sequenz im relevanten Bereich binden. Zum Beispiel, wenn diese...
Die Nukleotidsequenz gibt an, welches Ziel Sie anvisieren; genau danach sollten Sie suchen. Dies sind die beiden verschiedenen Stränge; wir haben das DNA-Material denaturiert und erhalten so zwei Stränge. Einer Ihrer Primer muss an dieses Ende des einen Strangs binden und nirgendwo sonst, und der andere Primer des Paares muss an das gegenüberliegende Ende des anderen Strangs binden und nirgendwo sonst.
Deshalb sind Primer bei der Entwicklung einer PCR so wichtig. Sie werden chemisch synthetisiert und bestehen aus kurzen Nukleotidsequenzen; daher werden sie auch Oligonukleotide oder Oligos genannt. Bei der Entwicklung einer neuen PCR müssen die Primer sehr sorgfältig ausgewählt werden.
Damit sie nur an ganz bestimmte Bereiche Ihrer DNA-Sequenz binden. Wenn Sie sie also entwerfen – und ich habe das während meiner Doktorarbeit ausführlich gemacht –, müssen Sie einen DNA-Abschnitt finden, den Sie nachweisen möchten. Dieser Abschnitt muss also in beiden Bereichen, an die Ihre Primer binden sollen, einzigartige Sequenzen aufweisen.
Es muss sich an einem Ende des einen Abschnitts und am anderen Ende des anderen Strangs befinden. Darüber hinaus muss auch der dazwischenliegende Abschnitt, der repliziert werden soll, für die PCR-Reaktion geeignet sein. Man muss also nicht nur zwei eindeutige Sequenzen für die Primer finden, sondern diese müssen auch den richtigen Abstand zueinander haben.
Wie gesagt, es ist wirklich wichtig, dass diese Primer genau an diese Stellen binden und nirgendwo anders, denn das verleiht der PCR ihre Spezifität. Jeder, der – wie ich – schon viel Erfahrung mit dem Design und der Validierung von Primern für PCRs hat, weiß, dass es eine Reihe von Regeln gibt, die beim Primerdesign unbedingt beachtet werden müssen. Die Primer müssen also an die richtigen Stellen binden, sonst funktioniert die PCR nicht.
Und sie müssen wirklich gut binden, denn das verleiht dem Test seine Sensitivität. Genauso wichtig ist, dass sie nirgendwo anders binden dürfen, und zwar nicht nur an diese spezielle Sequenz, sondern an keine DNA, die sich möglicherweise in Ihrer Probe befindet. Das ist also eine ziemlich hohe Anforderung.
Und sie dürfen nirgendwo anders binden, denn das sorgt für die Spezifität. Würden sie an andere Bereiche binden, erhielte man falsch positive Ergebnisse. Daher ist es verständlich, wenn man zwei einzigartige Sequenzen gefunden hat, an denen man die Primer designen kann und die den richtigen Abstand zueinander haben.
Dann müssen Sie sich die Primer ansehen und sicherstellen, dass sie in Ordnung sind. Es gibt noch viele andere Dinge, die Sie überprüfen müssen. Es ist also wirklich wichtig, dass sie keine ungewöhnlichen Eigenschaften aufweisen, wie zum Beispiel die Bildung von Sekundärstrukturen wie Primerdimeren.
Primerdimere entstehen, wenn ein Primer an einen anderen Primer bindet, anstatt an die Zielsequenz. Und wenn sie aneinander binden, können sie natürlich nicht das erkennen, was man eigentlich will.
Ihr 5'-Primer kann an einen anderen 5'-Primer binden, wodurch ein Selbstdimer entsteht. Alternativ kann er an einen 3'-Primer binden (Kreuzdimer). Auch eine einzelne Sequenz oder ein einzelner Primer kann sich selbst binden und eine sogenannte Haarnadelstruktur bilden. Das ist unglaublich frustrierend, wenn man glaubt, die richtige Position für die Primer gefunden zu haben, und dann bei den Überprüfungen feststellt, dass sie unbrauchbar sind und man wieder von vorne anfangen muss. Es gibt noch ein paar andere Dinge, die Ihre Primer erfüllen müssen: Sie müssen die exakt richtige Länge haben.
Je länger der Primer ist, desto spezifischer ist er natürlich. Je mehr Nukleotide er enthält, desto besser bindet er an die richtige Stelle – genau das wollen wir erreichen. Sind die Primer jedoch zu lang, verläuft diese Bindungsreaktion nicht sehr effizient.
Sie müssen also genau die richtige Länge haben. Außerdem müssen sie GC-reich sein, und wie bereits erwähnt, bilden G und C drei Wasserstoffbrückenbindungen, was eine sehr stabile Bindung ermöglicht, im Gegensatz zu den nur zwei Wasserstoffbrückenbindungen zwischen A und T. Wir bevorzugen daher Primer mit einem hohen GC-Gehalt, da dieser die Bindung, insbesondere am 3'-Ende (einer sogenannten GC-Klammer), stabil macht. Das bedeutet, dass die Primer nach der Bindung fest verbunden und stabil sind.
Und nach all dem müssen Ihre beiden Primer natürlich unter denselben Bedingungen funktionieren, da sie sich ja im selben Reagenzglas befinden. Daher müssen Sie sicherstellen, dass sie ähnliche Schmelztemperaturen aufweisen und beispielsweise bei derselben Temperatur mit dem Zielmaterial fusionieren. Es sind also umfangreiche Validierungs- und Optimierungsarbeiten erforderlich.
Also. Primer zu entwerfen ist gar nicht so einfach, und sie zu testen und alle Bedingungen optimal einzustellen, ist eine echte Herausforderung. Falls dich dieser spezielle Aspekt der PCR interessiert, habe ich einen wirklich guten Blog mit vielen interessanten Artikeln gefunden. Den Link dazu findest du am Ende.
Der Grund, warum ich das erkläre, ist, warum PCR-Tests nicht alle gleich gut sind. Es könnten beispielsweise drei verschiedene PCR-Tests vorliegen, die alle behaupten, denselben Organismus nachzuweisen. Wahrscheinlich verwenden sie aber unterschiedliche Primer und werden unter unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt, weshalb ihre Leistungsfähigkeit nicht unbedingt gleich ist.
Und deshalb ist es so wichtig, dass Sie das verstehen. Sprechen wir also über den eigentlichen PCR-Prozess. Hier habe ich einen doppelsträngigen DNA-Abschnitt.
Das wird unser Hauptaugenmerk sein. Der erste Schritt der PCR besteht darin, die Probe auf etwa 95 Grad Celsius zu erhitzen, wodurch der Doppelstrang aufbricht. Anstelle des Doppelstrangs erhält man dann zwei separate Stränge.
Alle diese Nukleotide sind nun freigelegt und nicht mehr an andere Nukleotide gebunden. In diesem Stadium liegen also effektiv zwei Matrizenstränge vor, die jedoch in entgegengesetzter Richtung verlaufen. Im nächsten Schritt wird die Reaktion dann auf die Annealing-Temperatur abgekühlt. Bei dieser Temperatur binden die Primer idealerweise an die gewünschte Stelle.
Offensichtlich bindet also ein Primer an diesem Ende des einen Strangs und der andere am gegenüberliegenden Ende des anderen Strangs. Die Annealing-Temperatur hängt wiederum vom jeweiligen Primerpaar ab und kann zwischen 50 und 60 Grad liegen. Sie wurde jedoch während der Entwicklung und Erprobung der PCR optimiert.
In diesem Stadium befinden sich also alle freien Nukleotide in der Reaktionsmischung. Unser Enzym-Tag bindet an das Ende des Strangs und beginnt, die freien Nukleotide einzuschleusen. Dabei nutzt es den Matrizenstrang als Vorlage. Es analysiert die vorhandene Sequenz und erkennt beispielsweise: „Hier ist ein G, wir brauchen ein C, hier ist ein C, wir brauchen ein G, C, G.“ Anschließend wandert es entlang der Stränge und synthetisiert so neue DNA mithilfe des vorhandenen Strangs als Vorlage.
Es wird diesen Strang replizieren, aber auch den anderen Strang in umgekehrter Richtung. Und das setzt sich fort, bis der gesamte Strang repliziert ist. Wir begannen also mit einer Kopie des betreffenden Bereichs und haben am Ende dieses Zyklus nun zwei.
Fassen wir das also noch einmal zusammen. Die PCR besteht aus mehreren Schritten. Der erste Schritt ist die Denaturierung. Dabei wird die Probe auf etwa 95 Grad erhitzt, wodurch die Doppelstränge in zwei separate Einzelstränge getrennt werden, die beide als Matrizen dienen können.
Im zweiten Schritt, dem Annealing-Schritt, kühlen wir die Reaktionsmischung auf 50, 60 oder 65 Grad ab, damit unsere Primals einwirken und sich an die gewünschte Stelle binden können, idealerweise nirgendwo anders. Im dritten Schritt, der Extension, erwärmen wir die Mischung wieder auf etwa 72 Grad, da dies die optimale Temperatur für unser Tac-Enzym ist.
Dann beginnt im Grunde, einen neuen DNA-Strang zu synthetisieren, wobei der vorhandene als Vorlage dient. Es wird der komplementäre Strang hergestellt. Am Ende jedes Zyklus haben wir somit die Menge unserer Ziel-DNA im Reaktionsgefäß effektiv verdoppelt.
Im Wesentlichen wird dieser Zyklus dann viele Male wiederholt, bis das DNA-Fragment nachweisbar wird. Es gibt verschiedene Nachweismethoden. Das ist im Wesentlichen die PCR.
Wenn wir also darüber nachdenken, wie wir es nachweisen, dann ist das größtenteils das, womit ich mich in meiner Doktorarbeit beschäftigt habe. Wir verwenden eine Technik namens Agarose-Gelelektrophorese. Man gießt diese Gele, die kleine Vertiefungen enthalten. Dann gibt man die PCR-Reaktion mit einem Ladepuffer hinzu, damit man den Reaktionsverlauf verfolgen kann, und pipettiert sie sehr vorsichtig in diese Vertiefungen.
Anschließend wird ein elektrisches Feld angelegt. Da das DNA-Rückgrat negativ geladen ist, wandern die DNA-Fragmente zur positiven Elektrode, die sich am unteren Rand des Gels befinden sollte. Es sei denn, man begeht einen häufigen Fehler: Man setzt den Deckel falsch herum auf. In diesem Fall gelangen die DNA-Fragmente vom Gelrand in den Puffer. Oder man läuft zu schnell und vergisst dabei, dass man ein Gel führt. Dann kann es ebenfalls passieren, dass die DNA vom Gelrand in den Puffer läuft.
Mit etwas Glück passiert das aber nicht. Ihre DNA-Fragmente wandern zur positiven Elektrode. Wichtig ist dabei: Je kleiner das DNA-Fragment, desto schneller und weiter wandert es im Gel. Dadurch können wir die gesamte DNA in der jeweiligen Probe, abhängig von der Fragmentgröße, trennen.
Und natürlich wissen Sie bei der Entwicklung Ihrer Primer, wie weit diese voneinander entfernt sind. So wissen Sie, wie groß das DNA-Fragment ist, das Sie replizieren möchten. Anschließend können Sie Ihr Gel betrachten und feststellen, ob es positiv ist oder nicht und ob das Fragment die richtige Größe hat.
Um die DNA sichtbar zu machen, fügen wir unserem Gel einen fluoreszierenden Farbstoff hinzu. Dieser Farbstoff heißt Thiidiumbromid und lagert sich in die DNA-Moleküle ein. Unter UV-Licht leuchten diese dann auf.
Das hier ist ein Gel aus meiner Doktorarbeit. Wahrscheinlich nicht das beste, aber es reicht. An der Seite befindet sich außerdem eine sogenannte Molekulargewichtsskala.
Es handelt sich also um ein Gemisch aus DNA-Fragmenten bekannter Größe. Wir wissen beispielsweise, dass es sich um 50, 100, 200, 250 Basenpaare usw. handelt. Daher können wir die Banden in unserer Reaktionsmischung mit einer Molekulargewichtsleiter vergleichen.
Wir können also überprüfen, ob das sichtbare Band die richtige Größe hat. Wenn Sie eine neue PCR-Methode entwickeln und sicherstellen möchten, dass das richtige Molekül amplifiziert wird, können Sie nicht nur die Größe betrachten, sondern die DNA auch aus dem Gel ausschneiden und sequenzieren, um zu überprüfen, ob Ihre Primer die gewünschte Sequenz erkannt haben. Dies ist ein zusätzlicher Schritt. Je intensiver das Band unter UV-Licht ist, desto mehr DNA befindet sich im Gel.
Aber wissen Sie, das ist bestenfalls semiquantitativ. Es ist also keine wirklich quantitative Methode. Hier haben wir also die Molekülleiter.
Bei jedem PCR-Lauf wird eine Positivkontrolle verwendet. Dazu wird eine Probe mitgeführt, die den zu testenden DNA-Abschnitt enthält. Dies dient der Überprüfung, ob alle Komponenten der Reaktionsmischung und beispielsweise das PCR-Gerät korrekt funktionieren, um falsch-negative Ergebnisse zu vermeiden. Zusätzlich wird eine Negativkontrolle verwendet. Diese Probe enthält nicht die Zielsequenz und sollte idealerweise keine Banden zeigen. Ist eine Bande sichtbar, liegt eine Kontamination vor, und alle anderen Ergebnisse müssen verworfen werden.
Es ist also sehr wichtig, dass jeder PCR-Lauf eine Positiv- und eine Negativkontrolle enthält. Ich hatte ja angekündigt, kurz die Fachbegriffe zu erklären, da es da manchmal zu Verwirrung kommen kann. Bei der PCR, von der ich gerade gesprochen habe – der Standard-PCR – wird die DNA zwar gemessen, aber erst am Ende der PCR-Reaktion.
Man führt die Reaktion also über mehrere Zyklen durch und analysiert sie am Ende auf einem Gel. Das ist etwas ganz anderes als die sogenannte quantitative PCR (qPCR), die heutzutage viel gebräuchlicher ist. Bei dieser Technik wird die DNA-Menge während der Reaktion gemessen, sodass man am Ende jedes Zyklus sehen kann, wie viel DNA in der jeweiligen Reaktion vorliegt.
Deshalb wird es auch als Echtzeit-PCR bezeichnet, da die Reaktion in Echtzeit abläuft, oder als quantitative Echtzeit-PCR. Ich erwähne dies unter anderem, um Verwechslungen mit der sogenannten RT-PCR zu vermeiden, da die beiden Verfahren leicht verwechselt werden könnten. RT-PCR bezeichnet jedoch etwas anderes, nämlich die Reverse-Transkriptase-PCR. Dabei wird ein anderes Enzym verwendet, um RNA in DNA umzuwandeln, und anschließend wird die PCR an der DNA durchgeführt.
Ich wollte das nur kurz erwähnen, um eventuelle Verwirrung bezüglich der ganzen RTs und Qs zu vermeiden. Quantitative PCR ist wirklich faszinierend, denn wie gesagt, sie ist quantitativ, aber auch in Echtzeit. Man kann also sehen, wie viel DNA während der Reaktion produziert wird. Es gibt im Wesentlichen zwei Arten von qPCR.
Eine Methode basiert auf Farbstoffen. Dabei befinden sich in Ihrer Reaktionsmischung neben den freien Nukleotiden auch Farbstoffmoleküle. Während der PCR-Reaktion und der damit einhergehenden DNA-Synthese lagert sich der Farbstoff in regelmäßigen Abständen in die neu gebildete DNA ein. Je mehr DNA entsteht, desto stärker wird die Fluoreszenz. Diese Fluoreszenz kann mit speziellen Geräten gemessen werden, wodurch die DNA-Menge in Ihrer Reaktion quantifiziert werden kann.
Die zweite Art der qPCR ist die sogenannte sondenbasierte qPCR. Die Abbildung zeigt schematisch die Sonde. Neben einem Primerpaar besteht diese Sonde aus einem spezifischen Marker, der an eine Sequenz in der Mitte des Zielbereichs bindet. Dieser Marker wird mit einem Quencher-Molekül und einem Reportermolekül kombiniert.
Solange Ihre Sonde intakt ist, verhindert das Quenchermolekül die Signalübertragung des Reporters. Moment, da haben wir's. Solange Ihre Sonde also gebunden und intakt ist, verhindert der Quencher die Freisetzung von Fluoreszenz.
In dieser Reaktion habe ich nur einen Strang dargestellt. Hier bindet der Primer an ein Ende und die Sonde an die Mitte der Zielsequenz. Zu diesem Zeitpunkt ist die DNA noch intakt, der Quencher verhindert also die Freisetzung oder Messung von Fluoreszenz. Im Verlauf der Reaktion wird neue DNA synthetisiert. Sobald diese die Sonde erreicht, beginnt sie, die Sonde abzubauen, und der Quencher trennt sich vom Reporter.
Sobald das passiert, ist der Reporter natürlich frei und kann beliebig stark fluoreszieren. Genau das wird im Gerät anhand der Fluoreszenzintensität gemessen. Es handelt sich also um zwei leicht unterschiedliche Techniken. Die qPCR liefert uns zusätzliche Informationen, nämlich den sogenannten CT-Wert. Ich möchte kurz erläutern, was ein CT-Wert ist und warum er wichtig ist.
Und was bedeuten diese schönen Kurven? Manche behaupten, CT-Werte seien nicht so wichtig und der PCR-Wert sei eher eine Schwarz-Weiß-Sache, aber ich denke, das stimmt nicht. Ein CT-Wert ist tatsächlich eine sehr wichtige Information, die man kennen und verstehen sollte.
Bei der quantitativen PCR (qPCR) gibt es eine Art Hintergrundfluoreszenz. Diese muss überschritten werden, damit wir von einem echten Signal sprechen können, also davon, dass neue DNA synthetisiert wird. Das ist unsere Basislinie. Der CT-Wert gibt die Anzahl der PCR-Zyklen an, die nötig sind, damit die Fluoreszenz diesen Schwellenwert überschreitet.
Der CT-Wert ist also im Prinzip proportional zur Menge des Zielmoleküls in der Testprobe. Er ist indirekt proportional dazu, wie viel Zielmolekül ursprünglich in der Testprobe enthalten war. Je niedriger der CT-Wert, desto höher war also die ursprüngliche Menge des Zielmoleküls in der Testprobe.
Und es ist auch deshalb wichtig, weil es sich hier um eine logarithmische Beziehung handelt. Je weniger Zyklen man benötigt, um diesen Schwellenwert zu überschreiten, bedeutet im Grunde, dass man weniger Zyklen brauchte, um das Zielmolekül über die Nachweisgrenze zu bringen. Wenn man beispielsweise an einen Krankheitserreger denkt: Je niedriger der CT-Wert, desto mehr von diesem Erreger war zu Beginn der Reaktion in der Probe vorhanden, da weniger Zyklen benötigt wurden, um ihn bis zur Nachweisgrenze zu amplifizieren.
Und bei potenziellen Krankheitserregern ist das wirklich wichtig, weil es beispielsweise Aufschluss über die Viruslast gibt oder darüber, wie relevant der jeweilige Erreger ist. Könnte er tatsächlich für die klinischen Symptome verantwortlich sein? Daher sind CT-Werte meiner Meinung nach durchaus relevant.
Und so stellen wir das dar: Dies ist eine typische quantitative PCR-Kurve. Auf dieser Achse ist die gemessene Fluoreszenzmenge abgetragen. Auf dieser Achse ist die Anzahl der Zyklen der PCR-Reaktion dargestellt.
Und genau das misst das Gerät. Bei jeder dieser Farbkurven wurde mit einer unterschiedlichen Menge an Zielmolekülen in der Reaktion begonnen. Man sieht also, dass die Probe mit der höchsten Zielmolekülkonzentration zu Beginn die wenigsten Zyklen benötigt, um die Fluoreszenzschwelle zu überschreiten.
Also. Dieser Wert kreuzt sich hier ungefähr nach 12 Zyklen. Wohingegen man am anderen Ende von etwa 30, 35 Zyklen spricht, bevor man überhaupt etwas Signifikantes in Bezug auf Fluoreszenz feststellen kann.
Wenn man also Ergebnisse interpretiert, ist es wirklich wichtig, den CT-Wert zu berücksichtigen. Und persönlich, wenn eine Reaktion 35, 40 oder mehr Zyklen benötigt, um den Erreger überhaupt nachzuweisen, messe ich dem nicht so viel Bedeutung bei wie einem Ergebnis, bei dem er beispielsweise schon nach 12 Zyklen nachweisbar war.
Das war also ein kurzer Überblick über CT-Werte. Ich hoffe, das war verständlich und erklärt auch, warum sie wichtig sind. Nun zum Thema PCR: Wir werden uns jetzt die Vor- und Nachteile von PCR-Tests ansehen. Wobei „Vor- und Nachteile“ hier nicht ganz korrekt ist. Es geht vielmehr um die Punkte, die man bei der Durchführung von PCR-Tests und der Interpretation der Ergebnisse beachten sollte. Was genau sagt die PCR aus? Vereinfacht gesagt, zeigt sie lediglich an, dass eine bestimmte Sequenz genetischen Codes in Ihrer Probe nachgewiesen wurde.
Ich setze „wahrscheinlich“ in Klammern, weil das natürlich auch von der Spezifität Ihrer PCR-Primer abhängt. Bei der quantitativen PCR (qPCR) erhalten Sie außerdem einen guten Anhaltspunkt dafür, wie viel von dieser Sequenz zu Beginn der Reaktion vorhanden war. Das ist im Grunde alles, was es Ihnen sagt.
Vielleicht noch wichtiger ist es zu verstehen, was die PCR nicht aussagt. Wenn man beispielsweise nach einem potenziell pathogenen Organismus sucht, sagt die PCR nichts darüber aus, ob dieser Erreger intakt ist. Er könnte fragmentiert sein, und sein gesamtes genetisches Material könnte in Bruchstücken vorliegen. Und zufällig ist genau das Fragment, nach dem die PCR sucht, intakt und wurde gefunden.
Das bedeutet nicht, dass der Rest des Organismus intakt war. Oft lässt sich auch nicht feststellen, ob der Organismus tot oder lebendig war, obwohl einige neuere Methoden versuchen, Marker zu berücksichtigen, die Aufschluss darüber geben, ob er lebte oder nicht. Aber selbst wenn er lebt, muss er nicht unbedingt die klinischen Symptome oder die pathologische Läsion verursachen, die man untersucht.
Es sagt Ihnen nicht, wo sich dieser Organismus bzw. diese genetische Sequenz in der Läsion selbst befand. Es sagt Ihnen auch nicht, mit welchen Zellen oder Geweben er in Verbindung steht, und es sagt Ihnen auch nicht, ob eine Gewebereaktion oder Immunantwort darauf vorlag. Es gibt also eine ganze Menge Informationen, die es Ihnen nicht liefert.
Und ich denke, es ist wirklich wichtig zu verstehen, dass man bei der Interpretation von PCR-Ergebnissen unbedingt den gesamten klinischen Kontext berücksichtigen muss. Es gibt keinen perfekten Test. Wenn Ihnen jemand erzählt, ein Test sei perfekt, dann will er Sie leider nur auf den Arm nehmen.
Es gibt keinen perfekten Test, und der PCR-Test ist kein Beispiel dafür. Wie bei jedem Test sind falsch positive und falsch negative Ergebnisse möglich. Beispielsweise kann ein falsch positives Ergebnis durch eine Kreuzreaktion verursacht werden.
Möglicherweise detektiert dieses spezielle Primerpaar etwas anderes, das zwar eng mit dem Zielmolekül verwandt ist, aber fälschlicherweise das Falsche erfasst. Beispielsweise könnte die Probe verunreinigt sein. Deshalb verwendet man eine Negativkontrolle, um dies gegebenenfalls zu erkennen. Man könnte zwar einen Organismus nachweisen, dieser könnte aber tot, nicht lebensfähig oder fragmentiert sein, oder es könnte sich lediglich um einen Kommensalen handeln oder aus klinischer Sicht keine besondere Bedeutung haben.
Ein falsch negatives Ergebnis kann beispielsweise durch einen Probenahmefehler entstehen. Auch ungeeignete Primer können zu einem falsch negativen Ergebnis führen, wenn die durchgeführte PCR nicht die optimalen Primer verwendet. Das bedeutet, dass die gesuchte Sequenz zwar vorhanden ist, aber nicht nachgewiesen wurde.
Die Reaktion könnte aus irgendeinem Grund fehlschlagen; dafür haben wir natürlich unsere Positivkontrollen. Hoffentlich wird das in Ihrem Test erkannt. Oder vielleicht gibt es eine neue Sequenz. Wir haben während der COVID-Pandemie viel über neue Mutationen und neue Stämme gehört, und bestimmte Organismen, insbesondere bestimmte Viren, sind sehr gut darin, ständig neue Mutationen zu entwickeln.
Es ist also durchaus möglich, dass, wenn Sie nach so etwas suchen, eine Mutation vorliegt. Und wenn diese Mutation an der Stelle auftritt, an die die Primer binden sollen, könnte das bedeuten, dass Ihre Primer nicht mehr funktionieren. Klingt zwar unwahrscheinlich, ist aber möglich. All das sollte man bedenken.
Ich werde nun einige Beispiele für die Anwendung der PCR in der Veterinärmedizin betrachten, um Ihnen einige Anwendungsgebiete aufzuzeigen. Ich werde Beispiele für die genetische Diagnostik, die Tumordiagnostik und -prognose sowie den Nachweis potenzieller Krankheitserreger vorstellen.
Für das genetische Screening habe ich ein paar Beispiele ausgewählt, die, wie ich finde, relativ bekannt sind. Es gibt einige genetische Mutationen, die wir bei Katzen mit hypertropher Kardiomyopathie identifiziert haben. Wir haben diese beiden spezifischen Mutationen bei diesen beiden Katzenrassen gefunden.
Ich habe dieses Foto meiner Maine-Coon-Mischlingskatze hineingelegt und erst später bemerkt, dass sich meine Ragdoll – witzigerweise – in der Kiste darunter versteckt. Das passte also perfekt. Das zweite Beispiel, das ich für sehr gut halte, ist die polyzystische Nierenerkrankung, die wir bei Perserkatzen und verwandten Rassen untersuchen können, da wir wissen, dass es im PKD1-Gen einen Einzelnukleotid-Polymorphismus gibt, den wir nachweisen können.
Hypertrophische Kardiomyopathie ist ein Thema, das mich besonders interessiert. Wir kennen zwei spezifische Genmutationen: eine bei der Maine Coon und eine weitere, mit demselben Gen, aber einer anderen Mutation, bei der Ragdoll. Mithilfe der PCR können wir diese Mutationen nachweisen, was wesentlich dazu beigetragen hat, ihre Verbreitung in der Zuchtkatzenpopulation zu reduzieren. Homozygote Katzen werden daher nicht mehr zur Zucht eingesetzt. Aber auch die Untersuchung von nicht zur Zucht eingesetzten Katzen dieser Rassen gibt Aufschluss über das relative Risiko, später im Leben an hypertropher Kardiomyopathie zu erkranken.
Und Maine-Coon-Katzen, die homozygot für die entsprechende Mutation sind, neigen dazu, eine klinisch relevante HCM zu entwickeln. Allerdings ist dieses Verfahren nicht perfekt, und es gibt natürlich auch andere genetische Mutationen. So wurde festgestellt, dass auch Katzen ohne diese Mutation HCM entwickeln können. Daher ist es ein gutes Screening-Instrument, aber es liefert nicht die vollständige Antwort.
Interessanterweise sind diese beiden Mutationen fast ausschließlich rassespezifisch. Daher ist es sinnlos, Katzen anderer Rassen als Mine Coon oder Ragdoll auf diese Mutationen zu untersuchen. Es wird daher nicht empfohlen, ist aber dennoch ein nützliches Hilfsmittel. Eine weitere genetische Erkrankung, bei der PCR-Tests sehr hilfreich sind, ist die polyzystische Nierenerkrankung bei Perserkatzen und verwandten Rassen. Als ich 2004 mein Studium abschloss, sahen wir diese Katzen ständig.
Ich habe in Bristol studiert und daher viele Katzen bei Ultraschalluntersuchungen beobachtet, beispielsweise bei der Suche nach den typischen zystischen Läsionen in den Nieren. Ich habe diese Grafik von der Website der Tierarztpraxis Langford. Ich finde sie wirklich toll, denn sie zeigt, dass es durch dieses Screening auf diesen Gendefekt gelungen ist, den Anteil der Katzen mit positivem Testergebnis im Laufe der Zeit drastisch zu reduzieren.
Man kann also sehen, dass es ab dem Jahr 200 recht häufig vorkam, und die aktuellsten Daten stammen aus dem Jahr 2018. Durch die Verwendung dieses Screenings zur Auswahl der Zuchtkatzen konnte die Verbreitung dieser Krankheit in dieser speziellen Rasse reduziert werden, was ich großartig finde.
Ein weiterer Bereich, in dem wir PCR bereits häufig in unserer klinischen Praxis einsetzen, ist die Tumordiagnostik und -prognostik. Ich werde nur einige der häufigsten Beispiele nennen, aber ich denke, wir stehen hier erst am Anfang. In Zukunft würde es mich nicht wundern, wenn wir viel mehr Tumoren sequenzieren und nach verschiedenen Mutationssignaturen suchen würden. Und ich denke, je mehr wir über Tumoren lernen, desto mehr werden wir auch darüber erfahren.
Bei Menschen und Tieren werden wir nach spezifischen Mutationen suchen, die vorhanden sein könnten. Dies könnte uns bei der Tumordiagnostik und -prognose helfen, aber auch dabei, die wirksamsten Behandlungen für einzelne Patienten oder spezielle Fälle zu bestimmen, indem wir die im Tumor des jeweiligen Tieres vorhandenen Mutationen analysieren. Es wird also zu einer personalisierteren Therapieplanung kommen, und ich denke, die PCR wird dabei eine wichtige Rolle spielen. Schauen wir uns einige gängige Beispiele an, die bereits Anwendung finden. Ein Ihnen wahrscheinlich bekanntes Beispiel ist die PCR zur Suche nach Mutationen im CIT-Gen.
Dies gilt insbesondere für Mastzelltumoren bei Hunden, obwohl wir dies auch für gastrointestinale Stromatumoren nutzen können, und es gibt auch Studien zu oralen Melanomen bei Hunden. Bei Mastzelltumoren bei Hunden hat sich gezeigt, dass eine Mutation im Exon 11 dieses Gens mit einem kürzeren krankheitsfreien Intervall und einer kürzeren Überlebenszeit sowie einem erhöhten Sterberisiko und einem erhöhten Risiko für lokale oder systemische Rezidive einhergeht. Interessanterweise korreliert eine Mutation im X18-Gen nicht mit einem aggressiveren Tumorverhalten, aber das Vorliegen einer Mutation in einem dieser Gene erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmter Chemotherapeutikum gegen diesen Tumor wirksam ist.
Wenn also eine Mutation im X1.11-Gen oder Exon 8 des caninen Mastzelltumors vorliegt, spricht dieser mit höherer Wahrscheinlichkeit auf eine Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren an, da diese gezielt das Protein angreifen, für das das Gen kodiert. Dies ist daher sehr hilfreich bei der Auswahl der geeigneten Behandlung für das jeweilige Tier.
BRAF ist ein weiterer, häufig verwendeter Test. Dabei wird eine Mutation im BRAF-Gen nachgewiesen, die bei Übergangszellkarzinomen (auch Urothelkarzinome genannt) der Harnblase und auch bei Prostatakrebs auftritt. Ein positives Ergebnis ist sehr spezifisch, da diese Mutation beispielsweise nicht bei hyperplastischen Läsionen oder chronischen Entzündungsprozessen vorkommt, die ähnliche klinische Symptome aufweisen können. Ein negatives Ergebnis schließt einen Tumor leider nicht vollständig aus, da nicht alle diese Tumoren die Mutation tragen. Dennoch ist es ein sehr hilfreicher Test.
Es eignet sich zur Früherkennung dieser Tumore bei Rassen mit bekannt erhöhtem Risiko, oder im Rahmen von Untersuchungen. Bei klinischen Anzeichen, die auf einen Tumor als mögliche Ursache hindeuten, ist es eine gute Möglichkeit, diese auszuschließen. Da die Tumorzellen mit dem Urin ausgeschieden werden, können wir sie mithilfe der PCR untersuchen. Dank der hohen Sensitivität der PCR können wir die Mutation genau in diesen Tumorzellen nachweisen.
Das ist also ein weiteres Beispiel für die Anwendung der PCR. Ich habe heute leider keine Zeit, die Funktionsweise von PAR im Detail zu erläutern; das ist ziemlich komplex und würde eine eigene Präsentation erfordern. Aber auch PAR beinhaltet PCR.
Es steht wörtlich für PCR zur Bestimmung von Antigenrezeptor-Rearrangements. Und es ist in bestimmten Fällen ein wichtiger Bestandteil der Lymphomdiagnostik. Lymphome sind bekanntermaßen durch eine hohe Anzahl von Lymphozyten gekennzeichnet, aber auch bei reaktiver lymphoider Hyperplasie oder chronischer Entzündung können große Mengen an Lymphozyten auftreten.
Wenn Sie also feststellen möchten, ob eine bestimmte Lymphozytenpopulation neoplastisch oder lediglich reaktiv und entzündlich ist, können Sie untersuchen, ob sie klonal ist oder nicht. Wenn alle Lymphozyten in Ihrer Läsion von einem einzigen Klon stammen, ist es sehr wahrscheinlich, dass sie neoplastisch ist.
Wenn in einer Lymphozytenpopulation verschiedene Klone vorkommen, ist eine Entzündung wahrscheinlicher. Der PAR-Test hilft uns, dies festzustellen. Er ist besonders wichtig, um zwischen Lymphomen, atypischer reaktiver lymphoider Hyperplasie und chronischer Entzündung zu differenzieren.
Man würde eine Immunhistochemie für die Lymphoidmarker durchführen und gegebenenfalls auch eine PAR-Analyse zur Klonidentifizierung als Teil dieser umfassenderen Untersuchung einbeziehen. Dies ist ein weiteres Beispiel, bei dem die PCR bereits häufig in der klinischen Diagnostik eingesetzt wird. Die letzten Beispiele, die ich betrachten werde, betreffen den Nachweis potenzieller Krankheitserreger.
Generell ist die PCR besonders nützlich bei schwer oder potenziell gefährlichen Krankheitserregern, die man nicht kultivieren möchte, oder wenn deren Wachstum lange dauert oder sie in derselben Kultur von anderen Erregern überwuchert werden könnten. Ein weiterer Vorteil der PCR ist, dass sie auch an fixiertem Gewebe durchgeführt werden kann. Gelegentlich kommt es vor, dass man einen bestimmten Krankheitserreger diagnostizieren möchte, aber kein frisches Gewebe zur Verfügung hat.
Natürlich kann man aus fixiertem Gewebe nichts kultivieren, da alle Zellen abgetötet wurden. Wenn man aber fixiertes Gewebe hat, ist die PCR eine mögliche Option. Sie ist zwar besser an frischem Gewebe durchzuführen, da die Formalinfixierung die DNA schädigt, aber man kann die PCR trotzdem an fixiertem Gewebe durchführen, das man definitiv nicht kultivieren kann. Aber denken Sie daran, was ich vorhin gesagt habe: Die Interpretation ist entscheidend.
Sie wissen also, dass die PCR zwar anzeigt, ob ein bestimmter Sequenzabschnitt vorhanden ist oder nicht, aber sie sagt nichts darüber aus, ob der Organismus intakt war, ob er noch lebt oder ob er die klinischen Symptome verursacht, die Sie interessieren. Sie gibt auch keine Auskunft darüber, wo er sich in der Läsion befindet, welche Zellen und Gewebe betroffen sind und welche Gewebereaktion damit einhergeht. Hinzu kommen natürlich die Fragen, wie man bei Infektionen mit mehreren Erregern vorgeht. Daher ist es sehr wichtig, dass Sie neben dem CT-Wert auch die klinischen Symptome berücksichtigen, Ihre klinische Expertise einsetzen und das PCR-Ergebnis als Teil des Gesamtbildes betrachten.
Und deshalb sage ich, dass die Interpretation so wichtig ist. Wenn wir also über Infektionskrankheiten sprechen, weiß jeder, der mich kennt, dass ich mich sehr für Mykobakteriosen interessiere. Und dieser nette Kerl hier, das ist Brian.
Brian war also ein Patient von Professorin Danielle Gilmour an der Universität Edinburgh, und sie erlaubt mir freundlicherweise, ihn für alle meine Vorlesungen über Mykobakterien einzusetzen. Das ist also Brian. Ich verwende ihn besonders gern im Unterricht mit Studenten, und dann frage ich die Studenten: „Okay, was sind Ihre Diagnosen?“
Was sind die möglichen Ursachen für diese Wucherung an der Nase dieser Katze? Und es heißt immer nur: Tumor, Tumor, Tumor. Brian meint, nicht alle Wucherungen seien neoplastisch, weil er selbst eine Mykobakterieninfektion an der Nase hat.
Und Mykobakterienerkrankungen sind wirklich wichtig. Sie kommen überraschend häufig vor. Nicht jedem ist das bewusst, aber frühere Studien haben gezeigt, dass bei gut 1 % aller routinemäßigen histopathologischen Untersuchungen von Katzen in Großbritannien eine Mykobakterieninfektion diagnostiziert wird.
Das ist wahrscheinlich eine Unterschätzung, aber es kommt überraschend häufig vor. Auch die klinischen Erscheinungsformen sind sehr unterschiedlich; sie hängen unter anderem vom Immunstatus des Patienten und der Bakterienart ab, weshalb die Speziesbestimmung hilfreich ist. Auch der Infektionsweg spielt eine Rolle.
Die Diagnose kann mitunter schwierig sein. Sie bergen ein hohes zoonotisches Potenzial, was von großer Bedeutung ist, wobei dies für einige Mykobakterienarten stärker gilt als für andere. Daher ist es unerlässlich, im jeweiligen Fall die genaue Mykobakterienart zu kennen.
Und es ist möglicherweise auch behandelbar, wie Brian gerne zeigt. Wenn ich also an Mykobakterien bei Katzen denke, gibt es natürlich viele verschiedene Arten. Daher erscheint es mir am sinnvollsten, sie in zwei große Gruppen einzuteilen.
Es gibt also den Mycobacterium-tuberculosis-Komplex (MTB) und den nicht-tuberkulösen Mykobakterien-Komplex. Ich finde es sinnvoll, sie zu unterscheiden, da sie leicht unterschiedliche Eigenschaften aufweisen. Beginnen wir mit dem Mycobacterium-tuberculosis-Komplex: Dieser ist für etwa ein Drittel aller Infektionen bei Katzen verantwortlich und verursacht, wie der Name schon sagt, eine tuberkuloseähnliche Erkrankung.
Die Stämme sind wirtsspezifisch angepasst, was für die Pathogenese von großer Bedeutung ist. Sie führen jedoch nicht zu einer Immunsuppression des Wirts. Es gibt auch eine geografische Häufung: In bestimmten Regionen Großbritanniens ist die Wahrscheinlichkeit für eine bestimmte Art von Mykobakterieninfektion erhöht, und es ist ratsam, sich dessen bewusst zu sein. Betroffen sind vor allem Männer, Freigängerkatzen und Jäger.
In dieser Gruppe finden sich einige wichtige Arten, darunter M. mcoti. Dabei handelt es sich um einen an Nagetiere angepassten Stamm. Wenn Ihre Katze also jagt und infizierte Nagetiere fängt, ist sie gefährdet. Diese Form wird recht häufig nachgewiesen.
Wir haben Mbovis, die offensichtlich an Rinder angepasste Form, und diese ist ebenfalls recht verbreitet, insbesondere in bestimmten Teilen Großbritanniens. Und auch hier ist es sehr wichtig, sich dessen bewusst zu sein, da ein zoonotisches Potenzial besteht usw.
Und dann haben wir noch Mycobacterium tuberculosis. Dies ist die an den Menschen angepasste Variante.
Katzen besitzen eine sehr gute natürliche Resistenz, daher ist eine Infektion mit Mycobacterium tuberculosis äußerst selten. Dennoch gehört dieses Bakterium zu dieser Gruppe. Die nicht-tuberkulösen Mykobakterien hingegen sind Umweltbakterien und kommen überall um uns herum vor – im Boden, im Wasser. Sie können opportunistische Infektionen auslösen, in kontaminierte Wunden gelangen und befallen besonders gern immungeschwächte Patienten.
Daher ist es wichtig, bei Infektionen mit diesen Erregern nach möglichen Ursachen einer Immunsuppression zu suchen. Dazu gehören beispielsweise die Katzenlepra, der Mac-Komplex sowie einige langsam und schnell wachsende Mykobakterienarten. Histopathologisch sind Mykobakterien nicht sichtbar; daher wird eine Hämatoxin-E1-Färbung verwendet.
Wir sehen eine typische granulomatöse bis pyrogranulomatöse Entzündungsreaktion. Die Bakterien sind in der H&E-Färbung nicht sichtbar, aber dieses Muster lässt auf eine Infektion schließen. Wir verwenden eine Spezialfärbung namens Zielsen (ZN). Die blaue Farbe dient als Gegenfärbung und macht die Zellkerne sichtbar. Die dünnen roten oder magentafarbenen Strukturen stellen die Mykobakterien dar.
Wenn Sie also einen guten Tag haben und Glück besitzen, finden Sie in Ihrem Fall viele solcher Organismen, und die Diagnose gestaltet sich recht einfach. Häufiger jedoch sind bei Katzen nur sehr wenige Organismen in diesen Läsionen vorhanden, und die Suche nach einem einzigen winzigen Erreger in der Ziehl-Neelsen-Färbung kann sehr lange dauern. Daher kann die Diagnose recht schwierig sein.
So etwas kann einen schon misstrauisch machen. Die Ziehl-Neelsen-Färbung ist manchmal nicht sehr hilfreich. Wichtig bei der Histopathologie ist aber auch, dass ich die Mykobakterienart nicht allein durch das Mikroskop bestimmen kann.
Die Histopathologie eignet sich daher hervorragend als erste Diagnosemethode. Selbst bei einem negativen Ziehl-Neelsen-Test kann man eine Entzündung jedoch nicht völlig ausschließen. Bei reaktiven oder entzündlichen Läsionen, die einen starken Verdacht erregen würden, muss diese Differenzialdiagnose weiterhin in Betracht gezogen werden.
Die Histopathologie kann keine Spezies bestimmen. Es gab zahlreiche Studien, die versucht haben, ein bestimmtes Muster in den histologischen Verbindungen zu einer bestimmten Spezies zu erkennen, aber bisher wurden keine Ergebnisse gefunden. Daher sind bei einer positiven Diagnose weitere Tests erforderlich, um die genaue Art der Mykobakterien zu bestimmen.
Wie wir anhand der vorherigen Folien gesehen haben, kann dies von entscheidender Bedeutung sein. Ihre Optionen liegen also in der Kultur. Und das ist tatsächlich der Goldstandard.
Man benötigt frisches oder gefrorenes, aber nicht fixiertes Gewebe. Das Wachstum kann jedoch extrem langsam verlaufen. Es kann bis zu sechs Monate dauern, bis die Kultur aufgebaut ist und überhaupt etwas wächst.
Und in etwa 50 % der Fälle, in denen die Organismen auf der Ziehl-Neelsen-Färbung sichtbar sind, wächst überhaupt nichts. Daher liefert dieser Test oft auch nach sechs Monaten kein Ergebnis. Es gibt auch einen Bluttest, den Interferon-Gamma-Freisetzungstest, der sehr hilfreich ist; dafür wird allerdings eine Blutprobe benötigt.
Es ist ziemlich sensitiv und daher eine weitere Option, insbesondere wenn der Patient zu diesem Zeitpunkt keine Anzeichen einer tatsächlichen Läsion aufweist. Es ist ein sehr gutes Screening-Verfahren und kann einen guten Hinweis darauf geben, mit welcher Art von Mikrobiom es sich handelt. Wir haben aber auch die PCR.
Und die PCR ist besonders nützlich, weil Katzen in solchen Fällen oft mit einer Geschwulst eingeliefert werden, operiert werden und die Geschwulst vollständig entfernt wird. Man vermutet einen Tumor, legt das gesamte Gewebe in Formalin ein. Und dann diagnostizieren wir Mykobakterien und fragen: „Haben Sie vielleicht noch frisches Gewebe?“
Und sie sagen: Nein, wir haben alles in Ordnung gebracht. PCR ist in diesem Fall also tatsächlich eine Option. Frisches Gewebe ist zwar vorzuziehen, wie bereits erwähnt, da die Formalinfixierung die DNA schädigt, aber wir können PCR auch an formalinfixiertem Gewebe anwenden, um die Spezies zu bestimmen. Das ist sehr wichtig, wenn man entscheidet, ob und welche Behandlung nötig ist und ob man nach Immunsuppression sucht, wobei man auch andere intakte Tiere und die Infektionsquelle berücksichtigen sollte. Das sind also Ihre Optionen, und PCR ist definitiv ein Teil davon.
Es gibt noch einige andere klinische Szenarien, in denen die PCR hilfreich sein kann, aber nur im Rahmen einer umfassenderen Diagnostik. Die Konjunktivitis bei Katzen ist ein gutes Beispiel: Man kann ein PCR-Panel auf mögliche infektiöse Ursachen wie Herpesviren, Chlamydien und Mykoplasmen untersuchen, muss aber unbedingt alle nicht-infektiösen Ursachen ausschließen. Hierbei spielen der klinische Kontext und die klinischen Fähigkeiten eine wichtige Rolle. Dazu gehören beispielsweise Entropium, Reizstoffe, Fremdkörperverletzungen usw.
Und so weiter. Dann kann es passieren, dass man ein Panel durchführt und mehrere Proben positiv ausfallen. Was macht man dann? Hier spielen Dinge wie der CT-Wert eine wichtigere Rolle, denn wenn ein bestimmter Organismus in sehr hoher Konzentration vorhanden ist, deutet dies eher auf eine relevante Infektion hin.
Vergessen Sie aber nicht, das PCR-Ergebnis mit den klinischen Befunden abzugleichen. Betrachten Sie den Patienten also im Zusammenhang mit dem PCR-Test. Wenn beispielsweise ein dendritisches Ulkus vorliegt, das nahezu pathologisch für Herpesviren ist, und Ihr PCR-Test positiv ausfällt, dann sollten Sie sich wahrscheinlich auf die Behandlung dieses Ulkus konzentrieren. Um zu verdeutlichen, dass die PCR zwar ein nützliches Instrument im Rahmen der Diagnostik ist, aber immer im Zusammenhang mit den klinischen Befunden, CT-Werten usw. interpretiert werden muss.
Und dann noch Katzendurchfall. Ich hätte ihn beinahe nicht erwähnt, weil ich weiß, dass es ein recht kontroverses Thema ist. Viele Firmen bieten PCR-Panels an, die verschiedene Erreger enthalten und deren Nutzen unterschiedlich sein kann. Ich denke aber, es ist wieder ein gutes Beispiel dafür, wie wichtig die PCR im Rahmen einer umfassenderen Diagnostik sein kann. Dabei sind auch klinische Erfahrung und Interpretationsvermögen gefragt – Sie wissen das sicher viel besser als ich –, ob es sich um eine intestinale oder extraintestinale Infektion handelt, ob sie akut oder chronisch ist, ob sie den Dünndarm, den Dickdarm oder eine Mischung betrifft.
Könnte es nicht ansteckend sein, beispielsweise durch die Ernährung bedingt, oder sogar durch eine Infektion? Der Arzt muss viele Aspekte berücksichtigen. Sollte man jedoch eine Infektion vermuten, gibt es eine Reihe potenzieller Erreger, die man in diesem Fall mittels PCR-Test nachweisen kann.
Aber nochmal, es ist wirklich wichtig, die Ergebnisse im Zusammenhang mit dem klinischen Bild des Patienten zu interpretieren. Ist das positive Ergebnis relevant oder eher nebensächlich? Was tun Sie, wenn Sie mehrere positive Ergebnisse erhalten? Wir beobachten ja auch Koinfektionen mit einigen dieser Erreger. Die Qualität der Probe ist ebenfalls entscheidend. Eine optimale Stuhlprobe ist unerlässlich für die Zuverlässigkeit der PCR-Ergebnisse. Damit ist meine Präsentation beendet.
Falls jemand Fragen hat, beantworte ich diese gerne. Wenn Sie sich dafür interessieren und mehr darüber lesen möchten, empfehle ich Ihnen diese Website mit allen Informationen zu Primerdesign und PCR. Ich fand sie sehr gut lesbar und verständlich und kann sie nur empfehlen. Außerdem hat Emmy Barker vor einigen Jahren, genauer gesagt 2021, einen sehr guten Artikel für „In Practice“ geschrieben, der sich mit diesem Thema sowie der Durchführung und Interpretation von PCR bei Hunden und Katzen befasst. Der Artikel ist frei zugänglich, sodass ihn jeder lesen kann, der sich eingehender damit auseinandersetzen möchte.
Wir haben auch die Website von Zaita und diesen QR-Code. Wenn Sie ihn scannen möchten, gelangen Sie zu einer Seite mit vielen weiteren Informationen zu deren Produkten und PCR. Und falls Sie mich aus irgendeinem Grund kontaktieren möchten, ist dies auch meine E-Mail-Adresse. Es gibt also noch zusätzliche Informationen für alle Interessierten. Damit ist mein Vortrag beendet.
Großartig, vielen Dank, Melanie! Das war wirklich interessant und sehr ausführlich. Vielen Dank! Da gab es jede Menge Informationen zu verarbeiten. Normalerweise bitte ich die Teilnehmer an dieser Stelle, ihre Fragen in den Frage-und-Antwort-Kasten einzutragen, aber wir haben so viele bekommen, dass ich gleich loslege.
Zunächst einmal eine kurze Anmerkung und dann eine Frage: PCR wurde traditionell als etwas betrachtet, das im Labor und nicht in der Klinik Anwendung findet. Aber das ändert sich gerade rasant.
Gibt es mittlerweile Plattformen, die die allgemeine tierärztliche Praxis praktisch und einfach gestalten, ohne an Genauigkeit oder Sensitivität einzubüßen? Ja, und das ist eine der erstaunlichsten Entwicklungen der letzten Zeit. Als ich promovierte, war das Ganze hauptsächlich laborbasiert und wurde in der Forschung eingesetzt, aber mittlerweile sieht man das immer häufiger.
Diese Geräte, die Sie in der Praxis einsetzen können, sind so konzipiert, dass die ganze Vorarbeit bereits erledigt ist – die Optimierung der Primer, alle Tests usw. – und so aufbereitet, dass Sie nur minimalen Aufwand und wenig Fachwissen benötigen. Wenn Sie das richtige Gerät wählen, ist es in der Regel auch sehr einfach zu bedienen. Ja, es entwickelt sich immer mehr zu einer potenziellen Ressource für Ihre Praxis.
Hervorragend, vielen Dank. Wir haben noch eine Frage: Wir wissen alle, dass das Warten auf Laborergebnisse in stark frequentierten Kliniken eine Herausforderung sein kann, insbesondere wenn schnelle Entscheidungen wichtig sind. Wie verhält sich die Bearbeitungszeit zwischen dem Einsenden von Proben an ein externes Labor und der Durchführung einer PCR in der Klinik? Und wie wirkt sich das auf die Fallbearbeitung aus?
Ja, ich denke, man muss wirklich die Fälle bedenken, in denen eine schnelle Antwort entscheidend ist. Wenn man die Probe an ein externes Labor schickt, selbst an das beste der Welt, dauert es natürlich einen Tag – vorausgesetzt, die PCR-Tests werden täglich durchgeführt, die Kurierdienste sind im Einsatz und alles läuft nach Plan. Bei unseren internen Tests dauert ein PCR-Test hingegen weniger als eine Stunde, sodass man das Ergebnis viel, viel schneller erhält.
Und bei akuten Erkrankungen, bei denen man schnell eine Antwort benötigt – beispielsweise bei einem Hund mit akutem hämorrhagischem Durchfall, bei dem der Verdacht auf Parvovirose besteht –, ist es von unschätzbarem Wert, innerhalb einer Stunde eine Diagnose zu erhalten und dann die Behandlung, aber vor allem die Frage der Quarantäne zu klären. Man sollte auch die Ansteckungsgefahr für andere Tiere bedenken; das kann einen enormen Unterschied machen. Daher ist es in bestimmten Fällen definitiv sehr hilfreich, diese Informationen schnell abrufen zu können.
Fantastisch, vielen Dank. Worauf sollten Tierärzte bei der Auswahl einer PCR-Plattform achten, um sicherzustellen, dass sie sowohl klinisch relevant als auch zuverlässig ist? Ja, das ist eine wirklich gute Frage, und wahrscheinlich gibt es darauf keine eindeutig richtige Antwort.
Das hängt von Ihrer Klinik ab. Ich denke, all die Dinge, die ich heute besprochen habe – also wie robust die PCR ist, wie gut die Primer sind, ob es eine Positiv- und eine Negativkontrolle gibt, ob Daten veröffentlicht wurden, die die Validierung des Tests und seine Funktionsfähigkeit belegen – all diese Aspekte spielen eine Rolle.
Werden sie Ihnen Dinge wie CT-Werte mitteilen? Das wären alles Informationen, nach denen ich suchen würde. Aber auch, lässt es sich in Ihren Praxisablauf integrieren? Haben Sie den nötigen Speicherplatz dafür? Können Sie es einrichten?
All diese Dinge. Es gibt also viel zu bedenken, wenn man sich die verschiedenen Plattformen ansieht. Aber ja, hoffentlich hat Ihnen dieses Webinar die richtigen Fragen für Ihren konkreten Fall aufgezeigt. Das hoffe ich.
Wunderbar, vielen Dank. Wir haben nur noch ein paar Fragen, ist es zeitlich in Ordnung, wenn wir einfach weitermachen? Ja, okay, wunderbar.
PCR ist derzeit in aller Munde, und damit einhergehend kursieren oft einige Mythen, die Anwender von der Anwendung abhalten. Was sind Ihrer Meinung nach die häufigsten Missverständnisse, die Kliniker kennen sollten? Ich würde jedem, der PCR in der Praxis einsetzen möchte, raten, sich die verfügbaren Plattformen anzusehen. Man stellt sich PCR wahrscheinlich als etwas vor, das von Wissenschaftlern in weißen Kitteln in Forschungslaboren durchgeführt wird, aber mit einigen der neuen Geräte benötigt man heutzutage nicht mehr unbedingt molekularbiologische Kenntnisse, um sie zu nutzen.
Ich würde mir diese Plattformen mal genauer ansehen und solche Fragen stellen, zum Beispiel: Wie benutzerfreundlich sind sie? Ist die Benutzeroberfläche wirklich ansprechend und übersichtlich? Denn wahrscheinlich braucht man dafür keine tiefgreifenden Fachkenntnisse.
Noch wichtiger ist wahrscheinlich die Probenentnahmetechnik und die Gewinnung der richtigen Proben. Es gibt spezielle Plattformen, und man kann beispielsweise Stuhl- oder Serumproben verwenden. Ich werde Fragen stellen, wie viel Fachwissen man dafür tatsächlich benötigt, denn wahrscheinlich nicht so viel, wie man denkt.
Ja. Okay, hervorragend. Vielen Dank. Und dann noch eine Frage: David fragt, wir sehen Unternehmen, die PCR-Lösungen anbieten, und andere, die Lampenlösungen anbieten.
Beides sind molekularbiologische Techniken, worin besteht der Hauptunterschied? Ich kenne mich mit der LAMP-Methode nicht so gut aus, aber ich denke, vieles, was ich in dieser Präsentation betont habe, hängt mit einem guten Verständnis der Funktionsweise der Technik zusammen, damit man die Ergebnisse richtig interpretieren kann. Und das gilt für alle molekularbiologischen Tests.
Wenn Sie verstehen, wie dieser Test funktioniert, wissen Sie auch, was die Ergebnisse für Ihren Patienten konkret bedeuten. Wie ich bereits beim PCR-Test sagte: Was bedeutet ein positives Ergebnis? Nun, es bedeutet, dass diese bestimmte Sequenz nachgewiesen wurde. Das heißt aber nicht, dass dies Ihre Diagnose ist oder beispielsweise die Ursache für den Durchfall.
Ich glaube, dass diese PCR-Panels auch überbewertet werden. Bei bestimmten Erkrankungen wie beispielsweise Durchfall würde ich sehr genau prüfen, welche Erreger in diesen Panels enthalten sind. Sie sind nicht alle gleichwertig, und einige der enthaltenen Erreger sind nicht wirklich hilfreich. Daher wäre ich sehr wählerisch, für welche Fälle ich PCR und welche Tests einsetze.
Ich habe es in bestimmten Situationen angewendet. Ja, es ist wichtig, auch die Pathogenese zu verstehen und zu wissen, was es bedeutet, wenn ich diesen speziellen Organismus nachweise. Es steckt also viel mehr dahinter, als nur ein positives oder negatives Ergebnis.
Und dieses Verständnis wird Ihnen hoffentlich helfen, die Tests zu interpretieren. Fantastisch, das ist großartig. Ich denke, wir müssen für heute Schluss machen, aber es kommen noch unzählige Fragen rein. Wir könnten sie vielleicht alle zusammenfassen und einen kleinen Blogbeitrag dazu schreiben, den wir dann allen zukommen lassen, denn sonst sitzen wir hier noch eine Stunde.
Ich wollte mich noch einmal ganz herzlich bei Melanie für ihren Vortrag bedanken. Ein großes Dankeschön geht auch an unseren Sponsor ISAF für die Unterstützung dieser Veranstaltung. Nur zur Erinnerung.
Diese Sitzung wird innerhalb von 48 Stunden bearbeitet und auf die Webinarve-Plattform hochgeladen. Ihre Teilnahmebescheinigung steht Ihnen anschließend ebenfalls zur Verfügung. Wie immer wird diese automatisch Ihren CPD-Unterlagen hinzugefügt, die Sie ja sicher alle noch vor Jahresende aktualisieren möchten. Abschließend möchte ich mich noch ganz herzlich bei allen Teilnehmern bedanken, vielen Dank für Ihre Fragen. Wir hoffen, Ihnen hat die heutige Sitzung gefallen und freuen uns, Sie bald wiederzusehen.
Danke, Melanie. Danke an alle. Danke.
